堿性條件下，蛋白將Cu2 還原為Cu ， Cu 與BCA試劑形成紫藍(lán)色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。常用濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但受螯合劑(EDTA, EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類的影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
操作說明：
一. 微孔酶標(biāo)儀法
1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100μL（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足至20μL。
3. 將樣品作適當(dāng)稀釋（最好多做幾個(gè)梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20μL到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量樣品時(shí)誤差偏大，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2后。
4. 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置15-30分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定A562nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。
二. 分光光度計(jì)法 如沒有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。
步驟如下：
1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取100μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至1mL（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/mL。
3. 取八支（或者更多）5mL離心管，標(biāo)上號(hào)，按下表加入試劑。
4.37℃放置15-30分鐘。用分光光度計(jì)測(cè)562nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。