重組MIX是一款簡單、快速、高效的多片段DNA定向克隆產(chǎn)品，本試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點。將載體在克隆位點進行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的完全一致的序列(20 bp～40 bp)。將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合，在重組酶的催化下，僅需反應15-60 min即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡栃月士蛇_90%以上。

試劑盒中2×重組MIX預混了重組酶和重組反應所需緩沖液，并添加了特殊成分，可顯著提高重組克隆效率，可以一次實現(xiàn)多至6個片段的順序拼接克隆。

應用：

?  多片段克隆到目標載體

?  多片段組裝后作為PCR或RCA的模板

產(chǎn)品特點：

?   簡單高效的定向無縫克隆

?   靈活的序列設計，無需考慮酶切位點

?   無需PCR純化步驟

?   可同時進行最多6個DNA片段的組裝

質(zhì)量控制檢測  ：                                                                                            

使用Positive control組裝五個DNA片段，涂布于CI抗性平板上，最終用菌落PCR或質(zhì)粒酶切驗證，陽性克隆達到87.5%及以上。

使用說明

1、反應體系  

       冰上配制如下反應體系。

2×重組MIX                          10 μL

線性化克隆載體                        A ng

插入片度（PCR擴增產(chǎn)物  ）                B ng

ddH2O    Up to 20μL

注：如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心使其沉入管底；

重組Mix重組反應體系最適DNA使用量為每線性化片段0.03pmol。該摩爾數(shù)對應的DNA質(zhì)量可由以下公式計算獲得：片段添加量（ng）= 0.02×片段堿基對數(shù)（bp）（對應的片段濃度為0.03 pmol）。

2、重組反應

（1）在冰上解凍2×重組Mix，顛倒混勻。

（2）在無菌管中加入載體和片段（按上述要求），用無菌水補足到10μL，最后加入10 μL 2×重組Mix，用移液器輕輕吸打混勻避免氣泡產(chǎn)生。

（3）50℃恒溫反應15-50min，2-3個片段15min反應即可，4-6個片段需反應60min，在冰上放置3-5min。

3、轉(zhuǎn)化

（1）取化學轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞于冰上解凍。

（2）取上述反應液10 μL加入到感受態(tài)細胞中充分混勻。冰浴10min。

（3）將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90s，然后迅速放回冰上，使細胞冷卻2～3min。

（4）向離心管中加入已預熱的無菌LB(或SOC)培養(yǎng)液600μL，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)45～60min。

（5）短暫離心棄上清，吸取100 μL的新鮮LB培養(yǎng)基重新懸浮，將菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

4、 克隆鑒定

菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20～50μL LB 培養(yǎng)基中混勻，直接取1μL作為PCR模板，使用2×Taq DNA Polymerase Master進性菌落PCR實驗。

注意事項

?   為達到最優(yōu)的重組效果，請保證體系中PCR片段和載體的質(zhì)量，建議DNA樣品A260/280>1.8，濃度>40ng/ul。

?   多片段重組時，相鄰兩個DNA片段有互不相同的20-40bp同源序列，確保定向組裝。同源序列的長度由片段數(shù)目和長度決定，多片段重組建議設計40bp同源序列。同源序列需要避免重復序列、復雜二級結(jié)構(gòu)以及高低GC區(qū)域。

?   當?shù)玫降腜CR產(chǎn)物條帶單一時，可無需純化，產(chǎn)物可直接用于重組，注意產(chǎn)物添加量不可超過重組體系的1/10。

?   EDTA等金屬離子螯合劑對該產(chǎn)品有抑制作用，必須保證反應體系中不含該類螯合劑。